Il museo occupa gran parte di un antico convento dei Vallombrosani intitolato a San Salvi e prende il nome dal grande affresco raffigurante l’Ultima Cena, posto nel refettorio, opera di Andrea del Sarto, uno dei capolavori della pittura rinascimentale.

Nei vasti locali del convento sono collocati importanti dipinti della prima metà del Cinquecento, che documentano lo sviluppo della pittura fiorentina di quel periodo. Tra questi opere di Pontormo, Andrea del Sarto, Franciabigio, Raffaellino del Garbo, Giuliano Bugiardini, Bachiacca e il Monumento funebre a San Giovanni Gualberto, fondatore dei vallombrosani, ordinato nel 1505 a Benedetto da Rovezzano e rimasto incompiuto.